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T4 UvsX Recombinase

簡要描述:

T4 UvsX Recombinase公司正在出售的產(chǎn)品:人肝癌細胞(高轉(zhuǎn))-熒光梅標記 G蛋白偶聯(lián)受體83封閉多肽 產(chǎn)腸毒性大腸桿菌血清型PCR檢測試劑盒 大鼠新生甲狀腺(NN-T4)ELISA試劑盒 土壤有效硫活性比色法檢測試劑盒 淺黃色芽胞八疊球菌 鋅指蛋白568抗體

更新時間:2024-01-14

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T4 UvsX Recombinase

商品屬性:

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

貨號

T4 UvsX Recombinase

300μg

A-PJ1165

T4 UvsX Recombinase

3mg

A-PJ1165

描述:

UvsX 重組酶,來源于 T4 噬菌體,是 RecA/Rad51家族的同源體。RecA/Rad51 重組酶家族在雙鏈 DNA 斷裂的無誤修復和復制叉重新啟動的過程中起到重要作用。
T4 UvsX 重組酶可與其他重組酶一起錨定在單鏈 DNA 上并激活其在其他雙鏈 DNA 上尋找同源序列,以進一步完成鏈置換。經(jīng)檢測,該酶無核酸酶活性。

儲存:

置于-20°C 可保存 1 年,-80°C 長期保存,短期使用置于 4°C,保存一個月,避免反復凍融。
熱失活:60°C,10min。
酶儲存液:50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix:包含反應緩沖鹽、ATP、磷酸肌酸、dNTP、PEG、DTT、BSA 等,可用于 RPA 擴增試驗。該試劑 4°C
條件下放置 1 個月性能無下降。
基于本蛋白進行 RPA 反應測試的全套試劑

用于 RPA 擴增的測試引物與探針
CPV-F(20uM) CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
CPV-R(20uM) AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
Probe(10uM) CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
[THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
Canine parvovirus type 2,VP2
加入 1μl 的模板 DNA,上機反應前加入 1.25 μl 的 280 mMMg(OAC)2(終濃度 14 mM),總反應體積 25 μl?;旌暇鶆?,并離心,置于 39-42℃條件下反應 30min。
2. 進行熒光 RPA 擴增在進行熒光檢測時體系中,額外加入 0.3 μl 的 10μM Probe(120 nM的終濃度)和 50U 的 Exonuclease III(2U/μl 的終濃度),即可進行熒光檢測。本方法應用原理為 ExoIII 切割 THF 位點,使熒光與猝滅基團分離,報告熒光信號。
特別說明:
(1) 以上 RPA 擴增測試屬于蛋白功能性測試,按照以上實驗操作流程,可獲得 RPA 擴增產(chǎn)物。進一步的優(yōu)化,包括:X、Y、GP32、聚合酶、反應 Buffer,甚至加樣順序,均可能進一步提高 RPA 的擴增性能。
(2)關于 DNA 聚合酶的選擇, 測試了三種常見的 DNA聚合酶,在進行熒光法測定時,推薦的選擇順序依次為 Bst 4.0>Bsu> Sau,且在 42℃條件下,總能獲得最快的擴增速度,且熒光信號更強。在 Basic 擴增中 Sau 表現(xiàn)出特異性擴增能力更佳。
(3)關于 RPA 的靈敏度與非特異擴增,在 Basic 試劑的擴增中,仍然存在非特異擴增產(chǎn)物,這需要進一步優(yōu)化反應組分及引物序列。在使用熒光探針法時,但由于特異性探針的存在,非特異擴增產(chǎn)物通常無熒光信號值,但此時會影響檢測靈敏度。GP32 蛋白的
濃度增加會顯著降低非特異性擴增,但會導致擴增速度減緩,此時需要同步增加 X 與 Y 蛋白的用量,以維持 RPA 的擴增速度。
(4)據(jù)文獻報道,在進行試紙條 RPA 實驗時,傾向使用 Nfo 內(nèi)切酶又名 Endonuclease IV, 來對擴增探針進行切割,但  未予測試,目前無法提供相應參數(shù)。
(5)RPA 反應 Buffer 對擴增至關重要,輕微的濃度差異,均可導致擴增效率大幅下降,甚至失敗。RPA BufferMix 為粘稠試劑,使用時務必保證加樣準確,Tip 頭中的殘液務必打入 EP 管中。

QQ截圖20240110094643.jpg


PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛0暹M行稀釋。

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PCR基本步驟及注意事項?

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復制。在生物體內(nèi)DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現(xiàn)對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境;反應過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺期前結束反應, 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產(chǎn)物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品:

牛免疫缺損病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Traf2結合蛋白ELISA試劑盒 T2BP免費代測試劑

人腺病毒D53型探針法熒光定量PCR試劑盒

腸道致細胞病變?nèi)斯聝翰《?/span>PCR檢測試劑盒價格

凋亡相關半胱氨肽4ELISA試劑盒 Casp4免費代測試劑

淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒PCR檢測試劑盒說明書

豬圓環(huán)病毒型/豬圓環(huán)病毒型/偽狂犬病毒(PCV-/PCV-/PRV)核檢測試劑盒

胞質(zhì)分裂作用因子3ELISA試劑盒

輪狀病毒PCR檢測試劑盒

牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測試劑盒

毒蕈堿型受體M5ELISA試劑盒

羅斯河病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

綿羊附紅細胞體(綿羊嗜血支原體)探針法熒光定量PCR試劑盒

耳石蛋白1ELISA試劑盒

胰闊圓盤吸蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

牛眼莫拉氏菌染料法熒光定量PCR試劑盒

發(fā)動蛋白1ELISA試劑盒

鉤端螺旋體(Lep)核檢測試劑盒

牛腺病毒型PCR檢測試劑盒

芳基硫酯FELISA試劑盒

禽腺病毒C型探針法熒光定量PCR試劑盒

綿羊附紅細胞體(綿羊嗜血支原體)探針法熒光定量PCR試劑盒

防御β127ELISA試劑盒

口蹄疫病毒SAT1亞型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

綿羊痘病毒PCR檢測試劑盒

分揀蛋白1ELISA試劑盒

鉛黃腸球菌PCR檢測試劑盒價格

牛乳頭瘤病毒PCR檢測試劑盒直銷

復合3ELISA試劑盒

漏斗狀帶絳蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

羅斯河病毒PCR檢測試劑盒說明書

人補體片段3d(C3d)試劑盒ELISA

禽皰疹病毒1PCR檢測試劑盒價格

南沙參染料法PCR鑒定試劑盒

人抗風疹病毒IgM抗體(anti-RVIgM)ELISA試劑盒

同性戀螺桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

馬炎病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

γ分泌激活蛋白(PION)檢測試劑盒elisa

甲型副傷探針法熒光定量PCR試劑盒

絲狀支原體絲狀亞種型探針法熒光定量PCR試劑盒

人白介17(IL-17)ELISA檢測試劑盒

T4 UvsX Recombinase皮炎外瓶霉探針法熒光定量PCR試劑盒

豬瘟病毒/豬藍耳病病毒通用型/口蹄疫病毒通用型(CSFV/PRRSV-U/FMDV-U)核檢測試劑盒

人蛋白Z(Protein Z)ELISA Kit

禽腺病毒型PCR檢測試劑盒

 


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